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Bsu DNA聚合酶 大片段

簡要描述:

Bsu DNA聚合酶 大片段公司正在出售的產(chǎn)品:JC53BL(也稱為TZM-BL) 3號染色體開放閱讀框25封閉多肽 大腸彎曲桿菌PCR檢測試劑盒 大鼠醛固酮(ALD)ELISA Kit 磷烯醇式丙酮羧化(PEPC)活性比色法檢測試劑盒 產(chǎn)玉米副球菌 唾液結(jié)合免疫球蛋白樣凝集9抗體

更新時間:2024-01-12

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Bsu DNA聚合酶 大片段

公司產(chǎn)品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷!

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產(chǎn)品名稱

規(guī)格

A-PJ1055

Bsu DNA聚合酶 大片段

500U

Bsu DNA 聚合酶,來源于 嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus subtilis),系將 Bacillus subtilis DNA 聚合酶(Bsu) I 基因的前 296 個 AA 截去而得。該酶保留了Bsu I 的 5′-3′聚合酶活性,但是缺失了 5′-3′ 核酸外切酶結(jié)構(gòu)域,該大片段自身缺失 3′-5′ 核酸外切酶活性,可用于重組酶擴(kuò)增。
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應(yīng)用: 隨機(jī)引物法標(biāo)記
cDNA 第二條鏈的合成
單個 dA 的加尾
鏈置換的 DNA 合成
熱失活:75°C,20min。
活性定義:在 37℃條件下,30min 內(nèi)參入 10nmol 酸性不容物定義為 1 Unit。
1X Bsu Reaction Buffer: 50 mM NaCl ,10 mM Tris-HCl(Ph7.5) , 10 mM MgCl2 , 1 mM DTT
酶儲存液:50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM KCl, 1 mMDTT, 37.5% Glycerol.
儲存:置于-20°C 可保存 2 年,避免反復(fù)凍融。
注意:(1) 由于缺乏 3 ′-5 ′核酸外切酶活性,Bsu DNA 聚合酶不能切除 3′未配對的突出末端,因而不適用于生成平齊末端。
(2) 25℃ 時 Bsu DNA 聚合酶保留 50% 的活性,是同溫度下 Klenow 片段(3′-5′ exo-)的兩倍。

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PCR 反應(yīng)需要使用哪些試劑和設(shè)備?

試劑:
模板DNA:PCR反應(yīng)需要模板DNA,如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等;引物:PCR反應(yīng)的兩個引物,分別與模板DNA的兩端配對擴(kuò)增所需的特定區(qū)域,引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物;dNTPs:PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs,包括脫氧腺苷酸(dATP)、脫氧胸苷酸(dCTP)、脫氧鳥苷酸(dGTP)、脫氧胞嘧啶酸(dTTP),用于細(xì)胞分裂、DNA合成等生物學(xué)過程,用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增;Taq DNA聚合酶:PCR反應(yīng)需要的聚合酶,一般使用Taq聚合酶,還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等,用于擴(kuò)增DNA鏈;PCR buffer溶液:對PCR反應(yīng)具有緩沖作用,調(diào)節(jié)反應(yīng)pH,硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛,可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性,從而提高反應(yīng)效率;酶切體系:PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測序等等實(shí)驗(yàn)步驟,常常需要進(jìn)行酶切操作。MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn),用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒:用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物;
設(shè)備:
PCR儀:用于控制反應(yīng)溫度,保證PCR反應(yīng)時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴(yán)格控制;電泳槽:用于分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;核酸提取儀:從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設(shè)備在PCR分子生物學(xué)技術(shù)中均是,只有在有序齊全的基礎(chǔ)上,才能進(jìn)行PCR反應(yīng)并得出準(zhǔn)確結(jié)果。

PCR相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn):

PCR反應(yīng)基本步驟一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個循環(huán)組成,每個循環(huán)包括以下3個步驟:

一、變性:

利用高溫(93-98℃)使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環(huán)之前,通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離,僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘,接下來PCR儀就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段。

二、退火或稱接合,復(fù)性:

在DNA雙鏈分離后,降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點(diǎn)5℃。錯誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯誤地結(jié)合。該步驟時間1-2分鐘。

三、延伸:

DNA聚合酶由降溫時結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補(bǔ)鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統(tǒng)的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr(來自于嗜熱菌Thermus brockianus)約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應(yīng)條件優(yōu)化:

1、變性溫度和時間:

保證模板DNA解鏈?zhǔn)潜WC整個PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。加熱90~95°C, 30~60s,再復(fù)雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長,可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復(fù)性溫度和時間:

PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過程中引物與模板的結(jié)合。復(fù)性溫度越高,產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低,產(chǎn)物特異性越低。需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定。

3、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時,過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合,可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應(yīng)時間,可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定,小于1kb, 1min足夠;大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時間。這里需要注意,延伸時間過長可能出現(xiàn)非特異擴(kuò)增。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時間。

4、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后,PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后,PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值,實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%,因此不管模板濃度是多少,20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多,非特異擴(kuò)增增加。

公司正在出售的產(chǎn)品:

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